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显微镜光度术

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2011-01-15
使用教程

为定量测定生物组织、细胞和细胞器中的化学成分,结合运用显微镜技术与光度术测量微小物体光强度的技术。1936年,瑞典生物学家T.O.卡斯珀松最先设计和使用显微镜光度术测量细胞中核酸对紫外光的吸收,从而在细胞原位间接测定了核酸的含量。它与一般光度术的区别是:显微镜光度术是测定像的光,而一般光度术是直接测定来自物体的光;与流式细胞术相比较,显微镜光度术测量速度慢,但能在定量测定物质成分的同时,确定它在组织或细胞中的位置。因此,显微镜光度术已成为一种灵敏的、多用途的显微定量分析手段。 
  显微镜光度术所用显微镜光度计是以显微镜为主体,加上光度测量系统(测量光阑、光电倍增管和单色仪等)和电学系统所组成。测量光阑位于样品中间像平面上,用于限定测定范围。根据特殊目的所设计的这类仪器,因部件不同,被命名为显微光度计、显微分光光度计、显微光密度计、细胞荧光光度计、扫描显微干涉仪等。根据光与物体相互作用的性质,显微镜光度术可分为吸收光度术、荧光光度术和反射光度术等。 
  显微镜吸收光度术  通过测定样品的透光度测定样品化学成分的技术。所用仪器的构造见图。选择单色光照明(一般选吸收峰值的波长),首先测量通过样品周围空白区的光强度I0,再测量通过样品的光强度 I,这样就可以得到样品的透光度(T)(TI/I0)。 进而推算出样品的吸光率(E)〔E=log(1/T)〕。根据朗伯-贝尔定律,EK·C·d,此处C为样品浓度,K为克分子消光系数,d为样品厚度。又因为Cm/d·B,所以mB·E/K,此处m为样品的质量,B为样品的面积。所以通过测量透光度,再转换为吸光率就可推算出样品的化学成分。

显微镜光度术<//p> 
  分别用波长为260纳米和280纳米的紫外光照射,可测定细胞中的核酸和蛋白质的含量。用波长为400~700纳米的可见光照明,可测定细胞中色素(叶绿素和血红素)的含量。用与细胞中特殊成分结合的染料来染色,利用染料与细胞中成分呈化学计量关系,则可通过测定细胞中染料的透光度来测定细胞中某种成分的含量。 表1列出常用的测定细胞内一些化学成分的染色反应。

显微镜光度术

  由于细胞中成分分布不均匀,常造成吸收测量的分布误差,可用一波长两区域法、两波长一区域法或扫描法校正这种误差。扫描法可把测量面积减小到显微镜的分辨水平,在微小面积范围中可视被测成分为近似均匀分布,对整个样品进行全面积的逐点扫描后,把每个测点的化学成分加在一起,即可测得样品总的化学成分和面积的数值。利用这种高分辨的扫描技术,结合一些形态学分析,可对某些酶的分布和活性进行定量研究,分析核型和染色体带型。 
  显微光密度术  用透射光测定底片的吸收率(也称黑底)。适用于普通照相底片、显微摄影底片,电镜底片、X射线衍射底片、 光谱线底片和放射自显影底片等。样品的吸收光谱采用固定测量区域,用单位仪的不同波长分别扫描样品和空白区而测得。吸收光谱对于鉴别物质和掌握显微镜吸收测量条件都很有用处。 
  显微镜荧光光度术  测定材料在荧光显微镜下所产生荧光像的荧光强度的技术。由于荧光是由荧光物质直接产生,所以测量时没有分布误差、灵敏度高、且能利用不同的激发光测定一个样品的多种荧光物质,因而可对同一个细胞的多种成分如DNA、RNA和蛋白质进行相关测定。荧光强度的测定可用透射光或落射光照明,最常用的是利用落射光明场照明的荧光照明器。 
  在落射光照明时,荧光物质的浓度和荧光强度遵守以下公式:

FI0Qrel(1-显微镜光度术)

式中F为荧光发射强度;I0为照明的落射光强度;Qrel为相对量子产额;K为荧光物质的克分子消光系数;C为荧光物质的浓度;d为荧光物质厚度。 
  只有在一定的条件下(落射光照明和荧光物质低浓度时),荧光发射强度和荧光物质浓度间是近似的线性关系。与吸收光度术不同,因受仪器因素的影响,显微镜荧光光度术所测的荧光强弱只是一个相对的数值。所以需要一种荧光标准(一般用铀玻璃)来校正整个仪器状态。还需要一种生物样品作为内插标准(如淋巴细胞),它与所测定的样品同时染色和测量,以便于不同制备条件下的样品之间能互相比较。 
  利用显微荧光光度计可以测定:细胞中荧光物质如脂褐素、叶绿素和血红素的含量,免疫荧光的强度,神经递质生物单胺的荧光强度。此外,通过测定酶作用后荧光底物所产生的荧光强度可以测定酶的含量和酶的动力学参数。利用特异的荧光染料(表2)和细胞的一定成分相结合,如果二者呈化学计量关系,则通过测量荧光染料的荧光强度,可以间接测得细胞成分的含量。

显微镜光度术

  在物镜和光电倍增管之间加上一个单色器,则可通过改变波长测定荧光发射光谱,用于鉴别组织和细胞中的荧光物质,还可用于研究细胞中的能量转移现象。此外它也是掌握显微荧光测量条件所必要的。 
  显微荧光光度术的优点是在测量荧光强度的同时,还能确定荧光物质在组织及细胞中的部位。不足之处是测量时荧光容易消褪,还常有自发荧光和非特异性荧光的干扰,以至影响了测量的准确性。70年代以来用光多道分析仪测量细胞的荧光发射谱(仅用32msec),可弥补这些缺点。 
  显微镜反射光度术  通过测量显微自显影银粒反射光的强度来测量银粒密度的技术。显微放射自显影中银粒的数目与其反射光的测定数值呈线性关系,并且银粒数目与被标记的物质含量也呈线性关系,因此通过对银粒反射光的测定可推算出被标记物质的量。这比计数银粒快而且准确,当和显微镜荧光光度法同时利用时(如用荧光物质标记细胞内DNA),可以同时测出细胞中的银粒和与银粒重叠部位的荧光标记的物质含量(如细胞核内DNA)。要满足以上测量条件,应使显影的银粒尽可能均匀,并且银粒不要过密。测量银粒反射光可用垂直暗场或垂直明场照明两种方法。后者可以控制照明区域,在这种情况下可见到在暗背景中明亮的银粒。 
  显微镜光度术还可用于测量不染色生物样品的光程差,进而推算出物质的厚度和浓度(或质量)。 

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